草在寿命方面的研究报道尚少
一、夏枯引言
夏枯草(学名为PrunellavulgarisLinn英文名为CommonSelJheal)，草水为唇形科夏枯草属植物夏枯草的提物干燥果穗。夏枯草功能繁多，对黑如降血压、腹果降血脂、蝇寿影响抗菌、夏枯抗病毒、草水降糖、提物抗炎及免疫抑制、对黑治疗头疼眩晕、腹果抑制食管癌ECa109肿瘤细胞的蝇寿影响增殖、调控Raji细胞生长与凋亡、夏枯清除DPPH自由基和较强的草水抗氧化性。另外夏枯草作为一种药食同源的提物中药，其开发价值和开发前景非常广阔，但夏枯草在寿命方面的研究报道尚少。
草在寿命方面的研究报道尚少。本研究选用黑腹果蝇作为模式生物对夏枯草水提取物进行抗衰老作用研究。将夏枯草水提取物进行不同程度的稀释，并分别添加到培养基中饲喂果蝇进行寿命实验，在寿命实验的基础上，发现最高浓度的夏枯草水提物可以延长雌性果蝇寿命，因而对最高浓度进行了深入的研究，以一定时间内雌性果蝇产卵数目来评价夏枯草水提物对果蝇生殖系统的影响，以每分钟的活动次数来评价夏枯草水提物对果蝇睡眠的影响，以果蝇进食量来评价夏枯草对果蝇热量摄入的影响。为夏枯草在医药、保健品、饮料等相关产品的应用提供参考。
一、材料与方法
1、材料与仪器
夏枯草购买自本草铺，黑腹果蝇，美国BloomingtonDrosophilaStockCenter(BDSC)购买所得，基因型为Canton-S。
对羟基苯甲酸乙酯、琼脂粉、无水氯化钙、葡萄糖，均购买于国药集团化学试剂有限公司，分析纯AR；千岛湖纯净水、白砂糖、玉米粉，以上均购买自普通农贸市场；安琪酵母粉，京东；无水乙醇、95％乙醇以及丙酸，购买于杭州米克化工仪器有限公司；亮蓝，阿拉丁(上海)。
智能人工气候箱，宁波莱福科技有限公司；水热合成反应釜，西安常仪仪器设备有限公司内胆为聚四氟乙烯；电热恒温鼓风干燥机，上海精宏鼓风干燥箱DHG-9426ASHZ-D(III)型循环水真空泵，邦西仪器科技(上海)有限责任公司；0.229m水系滤膜，生工生物工程(上海)股份有限公司；果蝇活动监测器，美国Trikinetics公司；手动组织研磨器，生工生物工程(上海)股份有限公司l酶标仪，ThermoFisher；离心机，ThermoFisher；透明水浴锅，金坛实验仪器。
2、方法
（1）中药成分的提取
采用水热合成反应釜高温提取Illl，取夏枯草1.59加入60mL水，在lOOmL反应釜中，放入电热恒温鼓风干燥机中，反应条件为100℃，反应时间为3h，后冷却至室温，用229m水系滤膜真空抽滤机过滤，得到夏枯草水提物40mL(下文使用夏枯草水提物代指此步骤得到的溶液)。
（2）果蝇培养基
高热量(3.0X)培养基每升含琼脂15g、酵母300g、白砂糖50g、氯化钙0.7126g、对羟基苯甲酸乙酯9g溶于30mL的95％乙醇中、丙酸6mL，用来进行寿命实验。
(3)寿命实验方法
收集24小时内羽化的果蝇，进行随机分组并放置到新的果蝇管中，每管约为40只果蝇，使雌性果蝇与雄性果蝇随机完成交配。48h后，对交配过的果蝇进行区分雌雄，然后随机分组，每管中40只果蝇。寿命实验分为4个不同浓度：对照组(添加等量的蒸馏水100μL)、低浓度(1∶100稀释的粗提取液1009L)、中间浓度(1∶10稀释的粗提取液lOOgL)、高浓度(母液100μL)，每个性别3管。实验所用温度为25℃(相对湿度为60％±5％，12h亮12h暗)。实验每隔一天(0、2、4、6、……)定时为果蝇更换培养基，并统计死亡果蝇的数目，记录下每天果蝇的死亡数量。延寿率=[(实验组平均寿命一对照组平均寿命)］／对照组平均寿命×100％。
(4)进食量测定实验
参考文献收集方法，收集10天龄的雌雄果蝇各120只，对照组和实验组各60只，每个浓度分成3管，每管20只果蝇。实验所用基础培养基与寿命实验相同，在食物表面添加200μL浓度10.8％的亮蓝溶液、水1OOμL作为对照组，100μL夏枯草水提物作为实验组。将果蝇分别放入上述培养基中3h，之后零下18℃冷冻lh，加入1200μL去离子水，用手动组织研磨器研磨碎，高速恒温离心机9000r／min离心15min，取上清液200μL放入酶标仪中629nm处测量吸光度。
（5）热刺激
参考文献方法，收集10天龄的雌果蝇80只，对照组和实验组各40只，每个浓度4管，每管10只。将果蝇放人干空的果蝇管中，放入39℃的透明水浴锅中，每10min记录一次果蝇的死亡数量(果蝇面朝上躺在果蝇管底部，且20s内不再抽搐，则记录为死亡)。
（6）产卵实验
参考文献方法，收集10天龄的雌果蝇200只，对照组和实验组各100只，每个浓度5管，每管20只雌果蝇。实验所用基础培养基与寿命实验相同，在食物表面添加200μL浓度10．8％的亮蓝溶液、水100μL作为对照组，lOOμL夏枯草作为实验组。将果蝇放在上述处理之后的食物上，并放到与寿命相同条件的培养箱中，22h之后，清除雌果蝇，显微镜下计数果蝇卵的个数。
（7）睡眠分析方法
参考文献方法，收集10天龄的雌雄果蝇各80只，对照组和实验组各40只，每个浓度分成4管，每管10只果蝇。实验所用基础培养基与寿命实验相同，在食物表面添加水100I_tL作为对照组，lOOgL夏枯草作为实验组。放入Trikinetics公司的DAM仪器中进行监测，隔26h之后更换对照与实验组位置继续监测，使用pysolo进行数据分析，大于5分钟活动为0则认为果蝇在睡眠。
3、统计学分析
使用SPSSl7.0软件对果蝇寿命进行分析和OASIS结合Python的lifelines库(主要用于计算P—value)。
二、结果与分析
1、夏枯草水提物对果蝇寿命的影响
如表l所示不同浓度的夏枯草水提物对雌雄果蝇的平均寿命、最大寿命的影响，进食最高浓度的夏枯草水提物的雌性果蝇寿命相比较对照组有显著差异(P＜0.05)，延长平均寿命10.54％、中值寿命10％、最大寿命20％。其他浓度对雌性果蝇均没有效果，所有浓度对于雄性果蝇均没有效果。结果表明夏枯草水提物可以延长果蝇的寿命，但是具有性别差异性。
2、夏枯草水提物对果蝇进食量的影响
寿命与热量的摄人有密切的关系，另外由于寿命实验已经发现最高浓度的夏枯草水提物可以延长雌性果蝇的寿命，所以需要确定这种延长是否是通过抑制进食量达到的。亮蓝是一种蓝色染料，果蝇进食之后会使其肠道染色，从而根据亮蓝含量的多少来检测进食量的多少，亮蓝的含量可以通过在629nm处的吸光度来检测，吸光度越大含量越高。
通过图1分析得到，进食高浓度夏枯草水提物之后会提高果蝇的进食量，其中雌性提高24.42％(P＜0.05)。雄性提高37.4％(P＜0.05)。
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