参灰成分具有多种活性功能

灰树花（Grifolafrondosa）一种名贵的天麻药食用真菌，以子实体或菌丝体作为食用部分，参灰成分具有多种活性功能，树花如：抗氧化、固态降血糖、发酵降血脂、对基的影抗肿瘤、质主清除重金属，活性并且含有较为丰富的天麻生物活性物质，如，参灰成分灰树花多糖、树花多酚、固态甾醇类、发酵萜类等活性成分。对基的影传统灰树花固态培养主要是质主利用木屑、稻草以及农作物副产品作为生长基质，灰树花采收后，菌糠则被丢弃，造成很大的资源浪费及环境污染。

开发一种新型的灰树花生长基质，并完全利用其发酵基质具有很高的研究价值。通过前期的实验将已优化的苦荞、薏仁米等各种基质的比例作为灰树花发酵基质进行实验。苦荞作为西南地区一种药食同源谷物富含黄酮类物质，其芦丁含量极高，薏仁米复含薏仁酯、薏仁素和丰富的淀粉物质，两者可以作为灰树花发酵基质，为灰树花的生长提供碳氮源。

天麻（Rhizomagastrodiae）一种名贵中药，复含天麻素（p-hydroxymethylphenyl-β-D-glucopyranoside，GA）、对羟基苯甲醇（p-hydroxybenzylalcohol，HA）、对羟基苯甲醛（p-hydroxylbenzaldehyde，HBA）、巴利森苷，具有很高的药理功效。课题组前期试验验证了添加一定比例的天麻提取物参与灰树花液态深层发酵能够显著地促进灰树花胞外多糖的分泌及生物量的增加以及分解利用天麻成分进行生物转化。将中药天麻以不同比例的添加量参与灰树花的固态发酵，进一步丰富和拓展中药资源与食用菌共发酵以及两者之间相互影响、生物转化的研究前景以及中药菌质产品的食药价值。

1材料与方法

1.1材料与试剂

灰树花（Grifolafrondosa，菌种编号：5.404）；天麻，贵州大方；苦荞，贵州威宁；薏仁米，贵州兴仁；天麻素对照品、对羟基苯甲醇对照品、对羟基苯甲醛对照品、巴利森苷对照品、芦丁对照品、异槲皮苷对照品；无水硝酸铝、亚硝酸钠；其余试剂均为市售分析纯

斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextroseagar，PDA）培养基

1.2仪器与设备

BXM-30R型立式灭菌锅；SW-CJ-1D型净化工作台；TGL-20M型台式高速冷冻离心机；CTFD-12S型真空冷冻干燥机；恒温培养箱；Agilent1100型高效液相色谱仪及检测器、Agilent5TC-C18型色谱柱

1.3实验方法

1.3.1灰树花固态发酵培养基配制流程示意图

1.3.2灰树花菌种培养方法

1.3.2.1斜面种子培养

从母种试管中挑取黄豆粒大小菌丝块接种于PDA培养皿中部，25℃恒温培养，至菌丝长满整个斜面，转置4℃保存。

1.3.2.2发酵培养

培养基成分组成：苦荞粉：4.5g；苦荞皮：1.5g；薏仁米：1.5g；麸皮：0.4g；葡萄糖：0.1g；

天麻粉：天麻烘干，超微粉碎机打碎成天麻粉，过60目筛。分别按照培养基质量分数的0、10%、20%、30%、40%、50%加入到发酵培养基中参与固态发酵。

将上述材料混匀加水，置于灭菌锅中灭菌（121℃、30min），培养基降低到室温，接入灰树花菌种于培养基中，放入恒温恒湿培养箱中进行生长发酵12d（25℃）

1.3.3发酵基质的处理

发酵基质在恒温恒湿培养箱中培养12d后，将其进行真空冷冻干燥，干燥之后的发酵物超微粉碎并过80目筛，收集粉末，置于-20℃条件下保存，作为实验材料。

1.4分析方法

1.4.1总黄酮含量的测定

精确称取0.4g菌粉，加入20mL50%的乙醇中，常温摇晃提取1h，8000r/min离心10min，取上清液，作为待测样品溶液。采用NaNO2、Al（NO3）3显色法测量，总黄酮含量以芦丁当量表示。

1.4.2天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷含量的测定

1.4.2.1色谱条件

色谱柱：Agilent5TC-C18型色谱柱（250mm×4.6mm，5µm）；洗脱程序：0~35min（0%~30%B），35~40min（30%~100%B），40~45min（100%~3%B）；流动相：0.1%的磷酸水（D）、乙腈（B）；流速：1mL/min；检测波长：221nm；柱温：30℃

1.4.2.2样品溶液的配制

精确称取0.5g发酵粉末，加入10mL75%乙醇，常温浸提12h，8000r/min离心10min，取上清液，作为待测样品溶液，按照上述高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，HPLC）条件进行天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷含量的测定，将各种物质的峰面积代入标准曲线，得到各种物质的含量。

1.4.3芦丁、异槲皮苷含量的测定

1.4.3.1色谱条件

流动相：0.02%的磷酸水、乙腈；流速：1mL/min；检测波长：360nm；柱温：30℃；等度洗脱：V（乙腈）∶V（0.02%磷酸水）=20∶80

1.4.3.2样品溶液的配制

精确称取0.5g发酵粉末，加入10mL甲醇，常温浸提12h，8000r/min离心10min，取上清液，作为待测样品溶液，按照上述HPLC条件进行芦丁、异槲皮苷含量的测定，将各种物质的峰面积分别代入标准曲线，得到各种物质的含量。

1.5数据处理与分析

所有的数据使用Origin10软件画图，使用SPSS19.0软件进行数据分析。实验数据以平均值±标准偏差（m±SD）表示（n=3），使用单因素方差分析（ANOVA）和配对t-检验进行显著性分析，P<0.05表示数据具有显著性差异。

2结果与分析

2.1灰树花固态发酵不同时间形态及表观结构的变化

图1为灰树花在未添加天麻培养基上生长变化。在生长7d时，灰树花菌丝体基本铺满培养基，且菌丝颜色亮白，联结致密，说明灰树花能够在基质上进行正常的生长，此种培养基未对灰树花的生长产生抑制作用。

图2为发酵组和未发酵组在不同天数时菌质的表观形态图。由图2可知，在发酵组，随着灰树花发酵时间的延长，基质结构产生大量细微的孔隙，在发酵终点时，基质由外到内均产生了较大的孔隙，结构近乎崩解，相比于发酵组，未发酵组基质在0~12d的表观结构形态均未发生明显的变化，结构均较为完整致密。

对比两者基质的表观结构，说明经灰树花发酵，对基质结构产生了显著的崩解作用，通过对基质结构的破坏，使得基质的营养物质更容易析出，增加了菌丝体与基质的接触面积，有利于菌丝体更好地吸收利用营养物质提供自身的生长代谢。

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