2.3 重组菌全细胞转化制备GABA的谷氨杆菌工艺优化2.3.1 温度对重组菌全细胞转化生产CABA的影响酶法制备GABA是一个不可逆反应，适宜的酸脱羧酶温度可以使GABA转化率达到最大，所以通过设置不同的枯草酶转化温度来探究温度对GABA转化率的影响。以100g/L的芽孢用谷氨酸为底物，溶于去离子水中，表达加入湿菌体(在55℃水浴锅预处理50min，谷氨杆菌改善细胞膜的酸脱羧酶通透性)30U/g，在150r/min的枯草水浴摇床中进行转化，反应过程中，芽孢用控制pH为5.0。表达温度梯度设置为25、谷氨杆菌30、酸脱羧酶35、枯草40、芽孢用45、表达50℃，反应24h后终止反应并进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释并过0.22μm有机滤膜后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测，结果见图9。转化率随温度升高逐渐提高.当转化温度达到40℃时，GAD-0和GAD-PL转化率达到最高，分别为64.78％和82.27％，继续升高温度，转化率反而降低。这是因为枯草芽孢杆菌细胞壁厚，而反应温度过低时，底物与胞内酶液无法充分接触使得转化率低：当反应温度过高时，酶与PLP稳定性差，从而影响GABA的转化率。
2.3.2 DH对重组菌全细胞转化生产GABA的影响以100g/L的谷氨酸为底物.溶于去离子水中，加入预处理过的湿菌体30U/g，在40℃、150r/min的水浴摇床巾进行转化，反应过程中，每隔2h用0.6mol/L的H2S04或NaOH调节pH，使其始终与初始pH保持一致。pH梯度设置为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，反应24h后终止反应并进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释并过0.22μm有机滤膜后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测。结果见图10，当pH为4.5或5.0时，GABA转化率最高，GAD-0的GABA转化率为75.45％和76.21％，GAD-PL的GABA转化率为84.54％和84.21％。当DH小于4.5时，底物-水谷氨酸钠在酸性条件下容易酸水解生成谷氨酸析出，从而形成乳白色浑浊液体.不利于酶与底物的充分结合；当pH大于5.0时不利于酶活性巾心的赖氨酸残基以shifft-碱与PLP、底物结合，从而抑制GABA的生成。可见，酶转化法制备GABA的pH耐受范围窄，过酸或过碱都不利于酶促反应进行，考虑在高质量浓度底物下，过低的pH更容易导致底物析出，所以酶转化最适pH为5.0。
2.3.3 加菌量对重组菌全细胞转化生产GABA的影响以100g/L的谷氨酸为底物，溶于去离子水中，加入预处理过的不同湿菌体(20、30、40、50、60U/g)，在40℃、150r/min的水浴摇床中反应24h，反应过程中，控制pH为5.0。反应结束后进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释后用氨基酸柱前衍生法进行HPLC检测。结果见图11，重组菌全细胞转化率随着加菌量的增加而逐渐提高，其中GAD-PL和GAD-0分别在40U/g和50U/g时将底物完全转化，转化率达到100％。GAD-PL的加菌量少于GAD-0是因为前者细胞巾的PLP含量高于后者，PLP作为辅助因子有利于酶促反应的进行。
2.3.4 反应时间对重组茵全细胞转化生严GABA的影响以100g/L的谷氨酸为底物，溶于去离子水中，加入预处理过的不同湿菌体，GAD-0和GAD-PL加入量分别为50U/g和40U/g，在40℃、150r/min的水浴摇床中反应24h，反应过程中，控制DH为5.0。反应结束后进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测，结果见图12。在0～20h，GAD-0和GAD-PL转化合成GABA的产量随时问延长迅速增加，在20h时转化率达到100％，之后随着反应进行，转化率不再发生变化。 2.3.5 底物质量浓度对重组菌全细胞转化生严GABA的影响以200g/L的谷氨酸为初始底物，溶于去离子水中，加入预处理过的不同湿菌体，GAD-0和GAD-PL力口菌量分另0为50U/g和40U/g，在40℃、150r/min的水浴摇床中反应6h后，每隔3h补加1.27g的谷氨酸同体至底物质量浓度分别为200、250、300、350、400g/L，反应过程中，控制pH为5.0，反应48h。反应结束后进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释并过0.22μm有机滤膜后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测。结果见图13，当底物质量浓度达到400g/L谷氨酸时，GAD-0和GAD-PL转化生产GABA的转化率分别从100％(底物质量浓度350g/L谷氨酸)下降为97.72％和98.43％。综合考虑，为提高工业生产效率和节省下游分离纯化成本，选择350g/L作为酶法制备GABA的最适底物质量浓度。
3 结语作者成功构建并重组表达了含有Escherichiacoli来源的gadB基因的重组菌B.subtilis/pHY300PLK-gadB。实验表明在发酵过程中添加0.5mmol/L辅酶前体PL的GAD总酶活达到28.14U/mL，是对照总酶活的1.72倍。进一步优化重组菌全细胞酶法生产GABA的工艺条件，结果表明，当温度为40℃，pH为5.0，GAD-0和GAD-PL的最适加菌量分别为50U/g和40U/g时，GABA转化率达到100％。当谷氨酸质量浓度为400g/L时，GABA产量分别为275.60扎和273.61g/L。综上所述，作者考察了菌体发酵培养过程中添加辅酶前体PL对重组菌产GAD及制备GABA的影响，开发了一种不需要在发酵过程和酶转化体系巾添加昂贵辅酶PLP就能高效生产GABA的T艺技术，为GABA在食品和医药行业中的广泛应用打下了坚实基础。 声明：本文所用图片、文字来源《食品与生物技术》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系 相关链接：谷氨酸，氨基酸，谷氨酸钠，枯草芽孢杆菌 |
热弯鱼缸和超白鱼缸的区别 汽车玻璃承受温度,行业资讯北京市朝阳区市场监管局举办首届干部职工运动会吉林镇赉：开展转供电环节价格专项检查不同防腐剂对烤制鱿鱼片贮藏品质的影响（三）甲减备孕前饮食注意事项客厅电视背景墙用玻璃做什么图案好 艺术玻璃背景墙应用,行业资讯响应面分析法优化艾叶药渣中白坚木皮醇乙醇提取工艺（一）客厅电视背景墙用玻璃做什么图案好 艺术玻璃背景墙应用,行业资讯吉林长春：信用全链条服务护航经济高质量发展响应面分析法优化艾叶药渣中白坚木皮醇乙醇提取工艺（一）我国认证制度改变出台新举措,行业资讯清洁玻璃窗背面有什么好办法 使玻璃窗擦得更干净的好办法,行业资讯无框玻璃是什么玻璃 玻璃无框窗材料,行业资讯玻璃瓶用于包装业的优点 如何DIY玻璃瓶彩绘,行业资讯什么是压延玻璃 玻璃生产工艺有几种,行业资讯如何自制简易鱼缸 自制鱼缸的尺寸是多少,行业资讯玻璃和玉石如何区分 什么是玉石玻璃,行业资讯提升男性生育力的秘诀：男孕检前饮食调整指南！玻璃地砖是什么 玻璃马赛克适合铺地吗,行业资讯手机的玻璃屏幕坏了要怎么换 什么是电容屏,行业资讯大型餐饮场所pm 25污染深入调查和对策建议（二）玻璃粉末是什么 玻璃粉有何应用,行业资讯海水水质实时在线检测系统的研究（二）致泻大肠埃希氏菌标准检验方法（一）备孕酸奶的合适饮用时间和正确保管方法晶钢门板是什么新型材料 晶钢门板材料有什么优点,行业资讯海水水质实时在线检测系统的研究（一）会议如期召开，涨价期待落实！,行业资讯电视背景墙烤漆玻璃的特点 烤漆玻璃背景墙的种类,行业资讯什么是微晶玻璃 玻璃幕墙有何性能要求,行业资讯钛化玻璃的作用 钢化玻璃和普通玻璃的区别,行业资讯衣柜玻璃推拉门怎么安装 玻璃移门安装方法,行业资讯如何调整饮食和生活习惯以提高备孕时乙肝抗体的水平？高效液相色谱法同时测定四川豆瓣中安赛蜜、 苯甲酸、山梨酸、糖精钠及脱氢乙酸（三）单面玻璃镜原理 单向透过玻璃安装步骤,行业资讯打碎的玻璃能循环使用吗 碎玻璃再利用有哪些途径,行业资讯阳台窗户用什么玻璃好 建筑玻璃窗如何检验质量,行业资讯
