甲醛是高效生物体代谢的一种成分，是液相一种对细胞有害的毒物，能够破坏生物体的色谱食中蛋白和酶，使组织细胞产生不可逆的法检毁坏，造成细胞死亡。测肉我国有规定禁止在国家标准以外的类零食品中以任何形式添加甲醛。但是甲醛还有一些不法商贩为了获取利益，利用甲醛定型、含量防腐，高效在肉类食品中添加甲醛，液相造成甲醛检测量超标，色谱食中严重损害消费者健康，法检引起严重的测肉食品安全问题。甲醛的类零检测方法有分光光度法气相色谱质谱法、高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，甲醛HPLC）[6-7]和电化学法等。HPLC检测具有干扰很小，操作简单，灵敏度高的特点，所以被广泛地应用在各行各业的甲醛检测领域。本文中运用直接衍生化的高效液相色谱法来检测肉类零食中甲醛的含量，检测的结果准确，灵敏度获得了较大的提升，能够提供建立肉类零食中甲醛含量的测定的方法的有效依据。
1.材料和方法
(1)材料与试剂
肉类零食，甲醛标准溶液（100μg/mL），色谱纯的甲醇和乙腈，实验用水为millipore用水；2，4-二硝基苯肼 （色谱纯）；其他试剂（分析纯）。
(2)设备
e2695高效液相色谱仪；色谱柱为WelchXB-C18（4.6mm× 250mm，5µm），组织捣碎机、恒温水浴锅、高速离心机。
(3)实验方法
①溶液配制
1，4-二硝基苯肼-乙腈溶液：用天平称量0.15g2，4-二硝基苯肼，用乙腈溶解定容至一升，配制成0.15g/L的2，4-二硝基苯肼-乙腈溶液；磷酸盐缓冲溶液：用电子天平称31.2gNaH2PO4·2H2O，用水溶解定容至一升，配制成0.2mol/L的NaH2PO4溶液；衍生液的配制：把磷酸盐缓冲溶液和2，4-二硝基苯肼-乙腈溶液以体积比为1:1混合均匀。
②样品溶液的制备
用研磨机把肉类零食磨碎，用天平称量2.0g，把待检测的样品放在50mL带塞子的离心管中，在管中加入配好的衍生溶液20mL，来回震荡使之混合均匀，选择60℃条件作为水浴反应的温度，反应时间为1h，反应结束后把离心管从水浴中取出自然冷却至室温，用离心机离心收取上清过滤，在高效液相色谱上检测。
③色谱条件
选择WelchXB-C18（4.6mm×250mm，5µm）作为色谱柱，体积比为70:30的乙腈-水作为流动相，控制流速为0.6mL/min，在37℃的温度下反应，选择355nm作为检测波长，进样量是10µL，采用等度洗脱。
④标准溶液的制备
在有刻度的50mL离心管中分别加入体积数不同的甲醛标准溶液，再加入衍生液至20mL，混合均匀，配制成不同浓度的标准溶液，浓度分别为0µg/mL、0.1µg/mL、0.2µg/mL、0.5µg/mL、1.0µg/mL、2.0µg/mL、3.0µg/mL，选择60℃条件作为水浴反应的温度，反应时间为1h，反应结束后把离心管从水浴中取出自然冷却至室温，用离心机离心收取上清过滤，在高效液相色谱上检测，制作标准曲线，根据曲线计算样品中含有甲醛的量。
2.结果与讨论
(1)确定衍生温度和反应时间
本研究中的衍生温度分别是30℃、40℃、50℃、60℃、 70℃、80℃，设置三个添加水平，分别为2µg、10µg和40µg，选择衍生时间是一小时，通过实验来确定最佳的衍生温度。结果发现在60℃时产物的量最大，随着温度的升高会有下降。此结果也和相关文献中报道的一致，甲醛在60℃时
反应较快。
在之前实验的基础上，在60℃条件下反应时间分别是20min、40min、60min、90min、120min，设置三个添加水平，分别为2µg、10µg和40µg，通过实验来确定最佳的反应时间。在反应1h的结果做出标准曲线，计算回收率。如表1所示，发生反应的时间在60min（包含60min）以上，回收率都在90%以上，随着反应时间的延长，回收率也在升高，但是变化的不明显，从投入产出比的角度综合考虑，选择反应温度为60℃和衍生时间为60min。
(2)线性范围与检测限
之前配制好的甲醛标准溶液，在反应温度为60℃和衍生时间为60min的条件下反应，在前述的色谱条件下检测，设置空白对照，绘制标准曲线，如图1所示。根据图1可以看出，甲醛质量浓度线性范围很好的浓度是在0μg/mL～3.0μg/mL，将肉类零食粉碎后加入标准溶液依据标准曲线溶液的方法处理后，用色谱测定，去除空白对照后计算出检出限，结果表明加样量是2g时，本实验的最低检出浓度为0.08mg/kg。
(3)回收率
将粉碎研磨均匀的肉类零食样品，分别加入 2 µ g、 10µg、40µg3个水平的甲醛标准溶液，按照上述方法来计算回收率，每个水平做3个重复，计算回收率和相对标准偏差，结果如表2所示。从表中可以看出平均回收率的范围是87.11%-94.25%，相对标准偏差是0.67%-3.57%。
(4)精密度
取用研磨均匀的同一份3份，加入120µL 100µg/mL的甲醛标准溶液，优化好的实验条件下进行精密度实验，测定结果如表3所示。显示结果为相对标准偏差为0.58%，表明此方法具有很好的精密度。
3.结论
本文中的实验是用衍生液直接提取，用高效液相色谱法来检测肉类零食中含有甲醛量的分析方法。本方法是将提取和衍生一起进行，不仅节省前处理时间，还能使实验操作变得简便。本文中建立的检测方法具有精密度好，灵敏度高，准确性好的优势，能够在肉类零食中甲醛含量测定上应用。
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相关链接：甲醛，二硝基苯肼，色谱
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